Western Blot条带灰度分析：Image J和Graphpad运用

 同样，Image J软件进行WB条带定量分析时也存在两种方法，此处只列举一种方法，具体步骤如下。

1、下载安装，并打开Image J软件。

2、导入WB条带图片。File→Open→ 弹出对话框→选择文件夹→找到WB条带。

3、把图片转化成灰度图片：Image→Type→8-bit。这时WB图片将会随之改变。

4、消除图片背景的影响。Process→Subtract Background。在弹出的对话框中，填上50基本就可以了，也可以稍高些，并勾上Light background，点击OK即可。此时图片背景会变白一些。

5、设置定量参数。Analyze→Set Measurements。在弹出的对话框中勾选Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density。

6、设置单位。Analyze→Set Scale。在弹出的对话框“Unit of length”后面填上“pixels”，其他的不用改动。

7、把WB图片转换成亮带。Edit → Invert。

8、选择菜单栏下的一系列不规则圆圈，根据情况选择一种。然后将圆圈手动拉倒第一条带，并尽量将条带都圈起来。

9、点击菜单栏Analyze下拉出现的measurement，即可弹出你选定区域的灰度统计值。也可以点击快捷键（英文状态下的键盘m）。

10、手动移动不规则圆圈至下一条条带，重复8、9步骤，直至所有条带都被测量。

11、当测定完所有条带，选结果中的“Edit”的“Select All”，然后复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析。也可以直接在Results对话框中，选择File → Save as，直接导出excel表格。

12、在excel表格中将目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。

13、下载安装，并打开Graphpad软件。

14、在对话框左侧栏目“New table & graph”下选择“Column”。然后再右侧选择所要作的图形，以及是否显示误差棒等，具体如下图。

15、在弹出的表格中，填上excel中的比值。

16、然后点击菜单栏上Insert → New Graph of Existing Data... 。也可以在工具栏Sheet中的“New”条目下找到。（其实这步可以省略）

17、在弹出的对话框“Create New Graph”中，填写新图名称，选择分析方法，图形，以及误差棒的表示方法，具体如下。（其实这步可以省略）

18、此时，可以在工具栏下左侧的状态栏“Graphs”文件夹中找到所建新图“Date 1”。

19、此时可以对图形的外观进行修改，增加图片题目以及XY轴名称。直接在图上对应位置左键点击修改。

20、也可以借助工具栏“Change”中的功能键对图片的柱形图颜色、宽度、高度、间隔等进行调整。

21、然后点击工具栏“Export”将新建的柱形图导出。

22、上面只是单因素的柱状图构建方法。如果是双因素，应该在一开始选择“Column”时选择“Grouped”。切记！！